豚鼠核因子(NF-κB p65) ELISA 试剂盒

供体外研究使用，不用于临床诊断!

超敏ECL化学发光示意图

使用方法：

1.印迹膜制备：执行常规电泳、转膜、HRP标记的抗体或者HRP标记的核酸探针孵育、洗膜；ECL工作液含有HRP催化的发光底物，检测系统必须基于HRP酶标记的抗体或者核酸探针。充分的洗涤对于降低背景非常重要，所有步骤均在室温下完成。

2.ECL工作液的配置：在使用前取等量A液和B液，混合均匀并尽快使用；将膜片置混合液中，于室温下孵育约1分钟，每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2 ml以覆盖全膜片，注意不要在膜片表面形成气泡。

3.蛋白或核酸信号显现：

1).用平头镊钳住膜片，垂直置于吸水纸上以吸去过量试剂，仅留下少量液体覆盖表面，不可让膜干燥；

2).将膜片置于保鲜膜上，吸附蛋白面朝上，小心赶尽气泡；

3).用电子装置感光，或在暗室中用X光片曝光；

4).根据信号强弱适当调整曝光时间，也可选择不同时间多次曝光，以取得更佳效果。

应用

用于阻断能受体对人内皮细胞体外血管生成的影响研究

   普萘洛尔、酚妥拉明抑制人微血管内皮细胞体外血管生成目的研究离体情况下,p-AR阻断剂普萘洛尔、a-AR阻断剂酚妥拉明对人微血管内皮细胞增殖、迁移、成管及VEGF、VEGFR-2、Ang1、Ang2、Tie-2表达的影响。

方法

1.细胞免疫荧光鉴定内皮细胞：细胞采用免疫荧光染色Ⅷ因子进行鉴定。将人皮肤微血管内皮细胞和人脑微血管内皮细胞接种于24孔板爬片。待细胞融合至80%-90%时,4%冰固定20分钟,0.2%Triton X-100通透10分钟,羊血清封闭30分钟。兔多克隆Ⅷ因子（vWF）一抗4℃湿盒内过夜。TRITC标记的羊抗兔二抗室温孵育2小时（避光）。Hochest（1μg/ml）染核15分钟（避光）后10%甘油封片。正置荧光显微镜下观察、拍片（×200倍）。

2. Western blot检测人微血管内皮细胞a-AR的表达：未经药物处理的人皮肤微血管内皮细胞和人脑微血管内皮细胞经裂解获得总蛋白。BCA定量,沸水灭活。取总蛋白约40μg进行SDS-PAGE凝胶电泳后,转移到PVDF膜上。5%BSA封闭1小时,蛋白样品分别在4℃冰箱孵育兔多克隆抗α1-AR、α2-AR一抗过夜。次日在37℃孵箱中孵育相应的二抗1h。采用超敏ECL化学发光试剂盒显色,于暗室内压片,显影定影。

3.细胞增殖实验：将人皮肤微血管内皮细胞种植于96孔板,将不同浓度梯度的普萘洛尔（0,25,50,75,100μM）、酚妥拉明（0,10,30,50,70μg/ml）分别处理细胞48h。然后每孔加入10μlCCK-8,孵箱中继续培养2h。之后于酶标仪测450nm下吸光度值。

[试剂盒性能]

1. 检测范围：18.75 ng/mL – 600 ng/mL。

2. 灵敏度：低检测浓度小于1.0 ng/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

[说明]

1.由于现有条件及科学技术水平尚不能对所有供货商提供的所有原料进行全面的鉴定与分析，本产品可能存在一定的质量技术风险。

2.终的实验结果与试剂的性、实验者的相关操作以及当时的实验环境密切相关，请务必准备充足的标本备份。

3.不同批次的同一产品可能会有少许差别，如：检测限、灵敏度以及显色时间等，请依据试剂盒内说明书进行实验操作，网站电子版说明书作参考。

4.只有全部使用本试剂盒配套试剂才能检测效果，不能混用其他制造商的产品。只有严格遵守本试剂盒的实验说明才会得到佳的检测结果。

5.本公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量，预留充足的样本。

6.使用化学裂解液制备的组织匀浆或细胞提取液可能会由于某些化学物质的引入导致ELISA实验结果偏差。

7.若样本为细胞培养上清，因该类样本干扰因素较多，如：细胞状态、细胞数量、采样时间等，所以可能存在检测不出的情况。

8.某些天然蛋白或重组蛋白，包括原核及真核重组蛋白，可能因为与本产品所使用的检测抗体及捕获抗体不匹配，而不被检测出。

[试剂盒性能]

1. 检测范围：18.75 ng/mL – 600 ng/mL。

2. 灵敏度：低检测浓度小于1.0 ng/mL。

3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

[说明]

1.由于现有条件及科学技术水平尚不能对所有供货商提供的所有原料进行全面的鉴定与分析，本产品可能存在一定的质量技术风险。

2.终的实验结果与试剂的性、实验者的相关操作以及当时的实验环境密切相关，请务必准备充足的标本备份。

3.不同批次的同一产品可能会有少许差别，如：检测限、灵敏度以及显色时间等，请依据试剂盒内说明书进行实验操作，网站电子版说明书作参考。

4.只有全部使用本试剂盒配套试剂才能检测效果，不能混用其他制造商的产品。只有严格遵守本试剂盒的实验说明才会得到佳的检测结果。

5.本公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量，预留充足的样本。

6.使用化学裂解液制备的组织匀浆或细胞提取液可能会由于某些化学物质的引入导致ELISA实验结果偏差。

7.若样本为细胞培养上清，因该类样本干扰因素较多，如：细胞状态、细胞数量、采样时间等，所以可能存在检测不出的情况。

8.某些天然蛋白或重组蛋白，包括原核及真核重组蛋白，可能因为与本产品所使用的检测抗体及捕获抗体不匹配，而不被检测出。

豚鼠核因子(NF-κB p65) ELISA 试剂盒

ELISA检测试剂盒承诺

公司长期与各大科研单位保持着良好的合作关系，公司的产品质量及服务态度得到了他们的一致认可。笃玛生物本着客户至上的原则为客户提供优质产品，公司承诺产品有任何质量的问题免费包退换（非人为因素造成的）。公司提供免费代测服务，并且承诺收到样本七个工作日出结果，确保数据的准确性。

试验原理：
本试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。

完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：

（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；

（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；

（3）酶的底物；

（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；

（5）结合物及标本的稀释液；

（6）洗涤液，在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20缓冲盐水；

（7）酶反应终止液，常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的*终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。

自备材料
1）蒸馏水。
2）加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3）振荡器及磁力搅拌器等。

试剂盒安全性
1）避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
2）实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3）不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

操作注意事项
1）试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
2）实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
3）不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
4）使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
5）使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
6）洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
7）底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。
8）加入试剂的顺序应一致，以所有反应板孔温育的时间一样。
9）按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

背景

  超敏ECL化学发光试剂盒是化学发光系统，也称为超敏型ECL发光液，用于检测固定在膜上的蛋白或核酸，灵敏度高，背景低，检测灵敏度可达高飞克(femtogram)级，适用于检测痕量蛋白或核酸。发光信号持久，所采用的配方足以维持6小时以上的发光，便于反复曝光操作。与普通ECL化学发光底物相比，可明显减少一抗和二抗的使用量。

原理

   超敏型ECL化学发光底物试剂盒用于检测直接或间接标记辣根过氧化物酶（HRP）的抗体、抗原或者核酸。蛋白质或核酸在电泳后转移到印迹膜上，以HRP标记的抗体或探针结合膜上的目的蛋白或核酸，洗膜后置于用本产品配制的ECL工作液中，室温孵育数分钟，HRP使工作液中的鲁米诺（Luminol）氧化并发光，试剂中添加的增强剂可以使得这种发光大大增强。此光经X光胶片或者电子装置感光记录下来，可清晰显示蛋白质或核酸条带。