猴转录激活因子-5(ATF-5)酶联免疫试剂盒

猴转录激活因子-5(ATF-5)酶联免疫试剂盒 

实验原理

酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用的免疫学检测技术，其基本原理是利用抗原与抗体之间的特异性结合反应，通过酶促反应放大信号，检测微量的蛋白质、细胞因子等生物活性物质。ELISA实验中所需的试剂和耗材需满足一定的质量要求，以保证实验结果的准确性和可靠性。

检测前准备工作:

1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使用时洗涤液应为室温）。当日使用。

3. 标准品: 于10000×g离心1分钟，加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10分钟，上下颠倒数次，待其充分溶解后，用移液器将其轻轻混匀（浓度为8000pg/mL）。然后根据需要进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。建议配制成以下浓度：按照稀释方法图例 标准品&样品稀释液直接作为空白孔0ng/mL。如配制5ng/mL标准品：取0.5mL10ng/mL的上述标准品加入含有0.5mL标准品&样品稀释液的EP管中，混匀即可，其余浓度依此类推。 

4. 生物su化抗体工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，以生物su化抗体稀释液稀释浓缩生物su化抗体(1:100)成工作浓度。当日使用。

5. 酶结合物工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物(1:100)成工作浓度。

当日使用。

猴转录激活因子-5(ATF-5)酶联免疫试剂盒 

操作步骤：

1. 加样：设置空白孔、标准孔和待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl。注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。每次实验都应制作标准曲线。如果样品浓度过高，可以用样品稀释液进行稀释，使样品符合试剂盒的检测范围。

2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物su标记抗体工作液 100μl（取1μl生物su标记抗体加99μl生物su标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

3. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物su标记抗体工作液） 100μl，37℃，60分钟。温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

4. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

5. 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

6. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。

结果判断:

1. 每个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图，如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标，标准品的浓度为纵坐标，绘出标准曲线。

2. 推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或1.4，在软件界面既可根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；亦可将样品的OD值代入标准曲线的拟合方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

3. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 

实验注意事项

1. 抗原和抗体的储存：应严格按照说明书要求存放抗原和抗体，避免反复冻融和长时间暴露在高温环境中。同时要保证试剂盒未过期，以获得可靠的实验结果。

2. 加样技术：加样时应保证加入的体积准确且不产生气泡，避免加在孔壁的边缘，以免影响与固相表面的接触。加样时应在每孔的旁边放置一个加样对照孔，以监测加样的准确性和重复性。

3. 温育：温育是ELISA实验中的重要步骤，温育时间和温度的控制对于抗原抗体反应的进行和结果的影响至关重要。必须严格按照说明书要求进行温育，并注意保持恒温状态。

4. 洗涤：洗涤是ELISA实验中的一步，它可以去除未结合的物质，提高检测的特异性和灵敏度。洗涤时应保证每次洗涤时间充足，并更换洗涤液以保证洗涤效果。同时要避免在洗涤过程中产生气泡，以免影响洗涤效果。

样品收集、处理及保存方法

1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心 10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心 30 分钟取上清。

3. 细胞上清液：3000 转离心 10 分钟去除颗粒和聚合物。

4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心 10 分钟取上清。

5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解 冻并确保样品均匀地充分解冻。

什么时候进行ELISA测试时需要准备一系列稀释样本?

1)未知样本浓度:当你不知道样本中抗原或抗体的浓度时，准备一系列稀释样

可以帮助确保至少有一些稀释度落在ELISA的线性检测范围内。

2)避免信号饱和:对于浓度较高的样本，稀释可以防止信号饱和，即吸光度值超

出光度计的最大读数，从而保证结果的线性和准确性。

3)减少高剂量挂钩效应:在某些情况下，过高的抗原浓度会导致检测抗体无法形

成“夹心"结构，反而降低了检测信号，这称为“挂钩效应"。稀释样本可以避免这一

现象。

4)优化检测条件:为了找到最佳的检测条件和稀释度，初步实验通常会涵盖广泛

的稀释范围，以便后续实验可以直接使用最佳稀释度。

5)建立标准曲线:对于定量ELISA，需要使用一系列已知浓度的标准品来建立标准

曲线，未知样本的结果将与此曲线比较以确定其浓度。

6)控制非特异性结合:稀释样本可以减少非特异性结合，这种结合可能在高浓度

样本中更为常见。

7)实验重复性和可比性:为了确保实验的重复性和可比性，对于不同时间点或不

同实验条件下的样本，通常需要准备相同的稀释系列。

8)特殊样本类型处理:某些样本类型(如血清、血浆或含有抑制剂的样本)可能

需要稀释以减少背景干扰或抑制剂的影响。

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