猴细胞角蛋白20(CK20/KRT20)ELISA试剂盒

猴细胞角蛋白20(CK20/KRT20)ELISA试剂盒   

实验原理

酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种基于抗原抗体反应的免疫学检测方法。其基本原理是利用抗原抗体的特异性结合，通过酶对底物反应的显色反应，对样本中的待测物质进行定量或定性分析。ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便、适用范围广等特点，因此在生物医学研究、临床诊断和食品安全检测等领域得到了广泛应用。

样品收集、处理及保存方法

1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心 10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心 30 分钟取上清。

3. 细胞上清液：3000 转离心 10 分钟去除颗粒和聚合物。

4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心 10 分钟取上清。

5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解 冻并确保样品均匀地充分解冻。

猴细胞角蛋白20(CK20/KRT20)ELISA试剂盒 

植物样本处理：

植物组织的提取，不管是根茎组织还是叶片组织还是果实组织，都应该采用鲜重的计重方式，一般要遵循以下原则：

    1.称取的组织重量不能低于50mg。

    2.匀浆的比例按照10%，即1g组织加9ml的匀浆液，匀浆液一般选取PBS(PH=7.2-7.4)

    3.组织在匀浆器匀浆过程中，匀浆液应该分2次加进去，这样匀浆更充分。

    4.充分匀浆完成后离心取上清，离心机的转数选取2000-3000转每分，转数不宜超过5000.离心时间为15-30分钟。

准备工作

1.孔板室温平衡1小时

2.做好布板图谱

3.样本解冻

4.准备各型号的移液枪、枪头、量筒

5.准备双蒸水

6.根据样本量配好样本希释液

7.根据样本量及洗板次数配好洗液

8.若需要提前设置好振板器、洗板器

9.准备足够量的擦手纸

10.根据说明书提示，溶解标准品

11.配制不同浓度的标准品

12.配制质控品

13.根据预实验结果稀释样本

14.准备好封板膜

实验步骤

1. 准备：准备好所有试剂、材料和器具。

2. 温育：将包被有特异性抗体的酶标板放入37℃温箱中温育30分钟。

3. 加样：分别向各孔中加入标准品、待测样本，轻轻混匀。

4. 温育：将酶标板放入37℃温箱中继续温育30分钟。

5. 洗涤：清洗酶标板，除去未结合的抗原抗体。

6. 加酶标二抗：向各孔中加入酶标二抗，轻轻混匀。

7. 温育：将酶标板放入37℃温箱中继续温育30分钟。

8. 洗涤：清洗酶标板，除去未结合的酶标二抗。

9. 加底物溶液：向各孔中加入底物溶液，轻轻混匀。

10. 显色：将酶标板放入37℃温箱中继续温育15分钟。

11. 终止：向各孔中加入终止液，混匀。

12. 测量：在450nm波长下测量各孔的光密度值（OD值）。

试剂盒组成

操作注意事项

1. 试剂盒保存在 2-8℃，使用前室温平衡 20 分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶溶解后再使用。

2. 实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3. 浓度为 0 的标准品可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释 5 倍，终结果乘以5才是样本终浓度。

4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5. 所有液体组分使用前充分摇匀。

6. 若中英文说明书有误，请以中文说明书为准。

7. 20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按 1：20 稀释，即 1 份的 20×洗涤缓冲液加 19 份的蒸馏水。

8. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

结果判断

 绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

洗板方法

1.手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置 1min 后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板 5次。

2.自动洗板机：每孔注入洗液 350μL，浸泡 1min，洗板 5 次。

试剂盒会出现的问题及解决办法：

1. 加入反应终止液后，没有吸光值或吸光值偏低。

a.原因：未加入酶标记物。

解决办法：请按照操作步骤进行。

b.原因：试剂盒内容物未能充分回。

解决办法：确定试剂盒内容物回温后再进行操作。

c.原因：室温太低。

解决办法：若室温太低(<19℃)，请于操作步骤4，适当延长温育时间。

d.原因：未使用试剂盒的清洗液清洗。

解决办法： 请用试剂盒内所提供的清洗液清洗。

e.原因：试剂盒已过有效期限。

解决办法：请更换成仍在有效期限内的试剂盒。

2. 标准曲线线性不佳，或是平行性不好。

a.原因：温育位置避光不好或受到气流干扰。

解决办法： 请确认温育位置既不透光也不透风(如抽屉内)。

b.原因：操作时间拖太久。

解决办法：请在方法熟练后再进行操作。

c.原因：微孔间相互污染。

解决办法： 加样品时，请小心勿溅出微孔外，以免造成其它微孔的污染。

d.原因：标准品或酶标记物所加入的量不一致。

解决办法：请使用已校正过的移液枪，并确保其与吸头之间有高度密合性。

e.原因：添加样品或试剂的操作方法不正确。

解决办法：加样品或试剂时，吸头请勿接触微孔。

f.原因：洗板过程发生问题(如管路堵塞、洗完板后未立刻进行下一步骤)。

解决办法：请随时监控洗板机洗板过程，洗完后立即进行下一步骤。

3. 吸光值均偏高(或线性不够陡)。

a.原因：室温太高(>25℃)。

解决办法： 若无法降低室内温度，请适当缩短步骤4的温育时间。

b.原因：底物溶液受到污染。

解决办法： 若发现底物溶液已呈现淡蓝色，请不要再使用。

c.原因：反应时间超过太久。

解决办法：请控制反应时间。

d.原因：酶标记物污染了盒内其它试剂。

解决办法：使用过的吸头应立即丢弃，可避免试剂间相互污染，凡是试剂(特别是酶标记物与底物溶液)接触过的容器应立即清洗干净。(先以漂白水浸泡，再以清水冲洗干净，可确保无残留)

4. 阴性标准品的吸光值低于阳性标准品的吸光值。

a.原因：微孔中的试剂未能充分混合。

解决办法： 试剂加完后，需轻敲盘四周使其充分混合均匀。

b.原因：洗板过程发生问题(同2-f.)。

解决办法：请参考2-f.

c.原因：添加样品或酶标记物的量不一致。

解决办法： 请参考2-d.

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