蔗糖酶测试盒/微量法/100管/48样

蔗糖酶测试盒/微量法/100管/48样

  测定方法:分光光度法

  保存条件:低温避光保存

  注 意:正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

  CS(EC 2.3.3.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中,是三羧酸循环个限速酶,是三羧酸循环主要调控位点之一。

  CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸产生柠檬酰辅meiA,进一步水解产生柠檬酸;该反应促使无色的 DTNB 转变成的 TNB,在 412nm 处有特征吸光值。

  可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水。

  试剂一:液体 25mL×1 瓶,-20℃保存；

  试剂三:液体 0.5mL×1 支,-20℃保存；

  试剂五:粉剂×1 瓶,4℃保存。

蔗糖酶测试盒/微量法/100管/48样样本的前处理:

  ①称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

  ③弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,10g,4℃离心 10min。

  ⑤在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或200W,超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),用于线粒体 CS 测定。

  分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 412nm,蒸馏水调零。

  (1)在试剂五中加入 0.6mL 无水乙醇和 13mL 试剂四,混匀,37℃(哺乳动物)或 25℃(其

  (2)测定管:在 EP 管中加入 40μL 样本、880μL 试剂五和 40μL 试剂六,混匀,37℃反应 15min 后立即测定吸光值 A1。

  (3)计算 ΔA=A1-A2,每个测定管设一个对照管。

CS 活性计算:

  单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。CS(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr

  (4)按样本鲜重计算:

  CS(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=23.8×ΔA÷W(3)

  单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。CS(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.0475×ΔA V 反总:反应体系总体积,9.6×10-4 L;ε:TNB 摩尔消光系数,1.36×104 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.04 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

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